光学放大镜最大放大倍数可以达到很大,但是对光学显微镜来说分辨率是有极限的,显微镜分辨率为两个点可被识别为单独点的最小距离。光学显微镜从17世纪发明到几十年前,其分辨率一直受到一个似乎不可逾越的障碍的限制——衍射极限。就是说如果你用200x的物镜和20x的目镜组合,理论上你可以将物体放大4000倍,但是与100x的物镜和20x的目镜相比,你不能看到更多的细节,因为最小可见细节的分辨率仅限于瑞利判据。
显微镜有一个公式来定义分辨率,叫做瑞利判据。当透射光光学显微镜在非常高的放大倍数下使用时,点目标的图像可能会失真,可以看到被衍射环包围的模糊圆盘,被称为艾里斑(如下图)。这些衍射环限制了光学显微镜分辨样品的精细细节的能力,光学显微镜的分辨能力是指显微镜在不受艾里斑干涉的情况下分辨两个相邻结构细节的能力。因此,光学显微镜对相邻结构细节的清晰观察存在一个明显的极限,即显微镜的衍射极限,当爱里斑的中心与另一个爱里斑的第一级暗环重合时,刚好能分辨出是两个点是分开的。分辨率这取决于两个因素——光波长(λ)和物镜的数值孔径(NA)。光波长为照亮样品而发出的光的波长;数值孔径是物镜在一定角度内捕捉光线的能力,高分辨率取决于大的NA和短的波长。
综上所述,紫光的波长为405nm,加上良好的镜头与油浸(NA = 1.25),可以达到197nm分辨率。因此光学显微镜被限制在1500倍左右,因为放大倍数进一步增大并不能让你看到更小的细节。
亚衍射极限技术是在20世纪初提出的,但理论上的重大进展始于70年代末,但直到最近十年,这些技术才被普通研究人员所采用。一些提高光学显微镜分辨率的方法包括结构化照明超高分辨显微镜(SIM,如下图)和受激发损耗(STED)显微成像技术等。